HPLC

BAB I

PENFAHULUAN

            Di zaman yang modern seperti sekarang ini, perkembangan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi melaju dengan pesatnya. Tuntutan kebutuhan hiduplah yang menjadikan manusia giat mengembangkan ilmu pengetahuan dan teknologi. Berbagai ilmu dikembangkan, mulai dari ilmu sosial hingga ilmu eksak. Seperti salah satu ilmu eksak yaitu ilmu kimia. Dalam praktiknya secara umum ilmu kimia, yaitu ilmu yang mempelajari tentang sususnan, sifat, dan reaksi suatu unsur atau zat dalam berbagai jenis  benda material.

            Dalam ilmu kimia banyak aspek-aspek penelitian yang dilakukan. Seperti halnya, yang paling spesifik yaitu pemisahan molekul- molekul dari senyawa zat nya, atau yang disebut dalam ilmu kimia yaitu Kromatografi. Kromatografi terbagi menjadi berbagai macam lagi. Salah satunya yaitu “Kromatografi Cair Kinerja Tinggi” atau yang biasa di kenal HPLC.

Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Metode ini dikenal sebagai kromatografi cair kinerja tinggi. Teknologi kolom didasarkan atas penggunaan kolom berlubang kecil (diameter dalam antara 2 mm hingga 5 mm) dan isi kolom berupa partikel kecil (3mm hingga 50 mm), yang memungkinkan tercapainya keseimbangan secara cepat antara fase gerak dan fase diam. Teknologi kolom partikel kecil ini memerlukan sistem pompa tekanan tinggi yang mampu mengalirkan fasa gerak pada tekanan tinggi sampai 300 atmosfer, agar tercapai laju aliran beberapa ml per menit. Oleh karena sering digunakan jumlah zat uji yang kecil (umumnya lebih kecil dari 20 mg) untuk isi kolom tersebut di atas, maka diperlukan detektor yang sensitif. Dengan teknologi ini kromatografi cair dalam banyak hal dapat menghasilkan pemisahan yang sangat cepat seperti pada kromatografi gas, dengan keunggulan zat-zat yang tidak menguap atau tidak tahan panas dapat dikromatografi tanpa peruraian atau tanpa perlunya membuat derivat yang dapat menguap.

Fase diam dapat berupa cairan atau polimer, yang disalut atau terikat secara kimia pada permukaan penyangga sebagai lapisan tipis, yang mengurangi hambatan terhadap pemindahan masa, sehingga keseimbangan antara fase gerak dan fase diam dapat tercapai dengan cepat. Suatu fase diam cair harus mempunyai sifat praktis tak bercampur dengan fase gerak, umumnya fasa gerak perlu dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase diam cair, agar fase diam tidak terbawa dari kolom. Fase diam berupa polimer yang disalutkan pada penyangga umumnya lebih dapat bertahan. Suatu fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga lebih mudah pemakaiannya dengan beraneka ragam pelarut serta suhu yang lebih tinggi.

Komposisi fase gerak berpengaruh nyata terhadap kinerja kromatografi dan harus dikendalikan dengan cermat. Komposisi dapat mempunyai pengaruh yang jauh lebih besar terdadap faktor kapasitas daripada suhu, (faktor kapasitas = k adalah perbandingan waktu yang diperlukan selama berada dalam fase diam terhadap waktu yang diperlukan selama berada dalam fase gerak).

Bahan pengisi kolom lainnya dengan diameter yang lebih kecil, antara 3 mm hingga 10 mm, hampir seluruhnya berpori dan memberikan pemisahan yang lebih efisien dari pada partikel pengisi kolom berukuran antara 30 mm hingga 50 mm. Partikel tersebut dapat pula dibuat bersifat adsorpsi atau dilapisi dengan suatu fase diam. Dalam hal ini pengisian ke dalam kolom harus dibuat dalam bentuk bubur untuk mendapatkan efisiensi kolom yang tinggi, berbeda dengan partikel berukuran antara 30 mm hingga 50 mm yang dapat diisikan dalam bentuk kering.

Tiga bentuk kromatografi cair kinerja tinggi yang paling banyak digunakan :

1.      Kromatografi penukar ion terutama digunakan untuk pemisahan zat-zat larut dalam air yang ionik atau yang dapat terionisasi dengan bobot molekul kurang dari 1500. Fase diam pada kromatografi penukar ion umumnya resin organik sintetik dengan gugus aktif yang berbeda-beda. Pada resin penukar kation terdapat gugus aktif yang bermuatan negatif dan resin ini digunakan untuk pemisahan zat-zat bersifat basa, misalnya amina. Sebaliknya pada resin penukar anion teredapat gugus aktif bermuatan positif yang akan zat-zat dengan gugus fosfat, sulfonat atau karboksilat, yang bermuatan negatif. Senyawa larut air yang ionik atau yang dapat terionisasi akan mengalami tarikan oleh resin, dan perbedaan dalam afinitas akan menyebabkan terjadinya pemisahan kromatografi. pH fase gerak, suhu, jenis ion, konsentrasi ionik, dan senyawa organik tertentu yang berfungsi untuk memodifikasi dapat mempengaruhi tertariknya zat terlarut, dan variabel-variabel tersebut dapat diatur agar diperoleh derajat pemisahan yang diinginkan.

2.      Pada kromatografi partisi digunakan fase gerak dan fase diam dengan polaritas yang berbeda. Jika fase gerak bersifat polar dan fase diam non-polar, dikenal sebagai kromatografi fase balik, maka senyawa non-polar yang larut dalam hidrokarbon, dengan bobot molekul kurang dari 1000, seperti vitamin larut lemak dan antrakinon, dapat dipisahkan berdasarkan atas afinitasnya terhadap fase diam. Modifikasi pelarut fase gerak yang polar dengan pelarut yang kurang polar menyebabkan berkurangnya afinitas serta retensi senyawa pada kolom. Jika fase gerak bersifat non polar dan fase diam polar, maka zat yang bersifat polar, seperti golongan alkohol dan amina dapat dikromatografi. Fase gerak yang non-polar dapat dimodifikasi dengan suatu pelarut yang lebih polar, untuk mengurangi retensi dan mengubah pemisahan.

3.      Beraneka ragam senyawa non ionik dapat dikromatografi dengan kromatografi adsorpsi, dengan memilih fase diam dan fase gerak yang tepat.

BAB II

PEMBAHASAN

1.      Pengertian HPLC

              HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Chromatography, yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

         HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik.

     Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan fase bergerak. Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti methanol. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening, karena syarat sampel yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.

         Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya. Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.

2.      Fasa gerak dan fasa diam dalam HPLC

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT,  tetapi ada  beberapa sifat umum  yang disukai, yaitu fasa gerak harus :

·      Murni, tidak terdapat kontaminan

·      Tidak bereaksi dengan wadah (packing)

·      Sesuai dengan defektor

·      Melarutkan sampel

·      Memiliki viskositas rendah

·      Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

·      Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

Fasa diam yanng biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C-8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi). Misalnya air: asetonitril (80:20). Hal ini bergantung pada kepolaran anallit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatan untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah

3.      Komponen-komponen HPLC

Keterangan :

1.      Botol pelarut (reservoir)

            Botol untuk fase gerak (mobile phase) dapat berisi campuran eluen atau eluen murni disesuaikan dengan kepentingan analisa.

2.      Pompa (pump)

            Pompa berfungsi untuk memompa baik eluen dan sampel yang disuntikan melalui injektor. Sebagian besar pompa HPLC memiliki keluaran tekanan (output pressure) 1000-6000 psi dan mampu menghasilkan aliran sampai 20 mL/menit.

3.      Injektor (injector)

            Injektor adalah tempat untuk menyuntikan sampel ke dalam kolom. Sampel yang akan dimasukkan  ke bagian  ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom.

4.      Kolom (coloum)

            Kolom merupakan bagian yang sangat penting dari disebut cartridge, ada pula yang terbuat dari stainless steel. Kolom terdiri dari fase diam (oktil, oktadesil, fenil, nitril, amin, dll) yang terikat secara kimia dengan partikel-partikel silika berpori yang terdapat dibagian dalam kolom.

            Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.

            Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

1)      Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

2)      Kolom preparatif: umumnya memiliki  diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk  kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung  pada model KCKT  yang digunakan (Liquid Solid Chromatography,  LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion  Exchange Chromatography,  IEC, Exclution Chromatography, EC)

5.      Detektor (detector)

            Detektor yang paling banyak digunakan adalah detector ultra violet (UV)/Visible, fluorometer (terutama untuk zat yang memiliki panjang gelombang eksitasi dan emisi) dan detektor indeks bias.

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan  fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.  Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan  untuk mendeteksi banyak  senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang  sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV.

6.      Komputer (PC) dan Printer

            Komputer berisi software pengolahan data yang menampilkan grafik dari pembacaan absorbansi sampel terhadap perubahan waktu. Grafik hasil pembacaan disebut kromatogram.

1.      Cara Menggunakan HPLC

Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-mula sampel diinjeksi dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection hall. Dari injection hall ini proses utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke kolom oleh LC20AT dalam tekanan tinggi.

Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase diam yaitu biasanya H₂SO₄ 0,05 N dan CH₃OH berdasarkan afinitas elektron. Setelah terpisah, dengan berbagai perhitungan matematis, HPLC yang sudah disambungkan dengan komputer ini memberikan pembacaan berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan di bawah peak untuk mengetahui kadar analit.

Rumus perhitungannya adalah y = ½ b.h yaitu persamaan yang diplotkan dengan least square. Sesuai dengan pengerjaan least square, maka sebelum menggunakan HPLC untuk analit, kita harus membuat kurva standar terlebih dahulu dengan menggunakan larutan standar.

     Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek  dari Elusi Gradien adalah  mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang  tertahan kuat pada kolom.

Diagram alir HPLC

Adapun cara untuk melihat seluruh proses diagram alir HPLC, antara lain:

a.    Injeksi sample

               Proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.

b.    Waktu retensi

        Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.

c.    Detektor

         Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

d.    Interpretasi output dari detector

         Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menyerap sinar UV. Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama.

Kelebihan dan Kekurangan HPLC

a.      Kelebihan High Performance Liquid Chromatografi:

·      Isolasi zat yang tidak mudah menguap (non volatile)

·      Isolasi zat yang secara termal tidak stabil

·      Dapat diopersikan pada suhu kamar

·      Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

·      Sudah digital sehingga penggunaannya cepat, mudah dan lebih praktis

·      Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

·      Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

·      Resolusi yang baik

·      Dapat digunakan bermacam-macam detektor

·      Kolom dapat digunakan kembali

·      Mudah melakukan "sample recovery"

b.      Kekurangan High Performance Liquid Chromatografi:

·      Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu

·      Hanya bisa digunakan untuk asam organic

·      Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi

·      Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

BAB III

KESIMPULAN

1.      HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Cromatography, yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.

2.      Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya sedangkan prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan kepolaran afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggungakan integrator atau menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.

3.      Keuntungan dari penggunaan HPLC yaitu :

·         Lebih teliti

·         Sudah digital sehingga penggunaannya cepat dan lebih praktis

·         mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

·         mudah melaksanakannya

·         kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

·         dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

·         Resolusi yang baik

·         dapat digunakan bermacam-macam detektor

·         Kolom dapat digunakan kembali

·         mudah melakukan "sample recovery"

4.      Kerugian dari penggunaan HPLC yaitu :

·         Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu

·         Hanya bisa digunakan untuk asam organic

·         Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi.

·         Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas