BAB
I
PENFAHULUAN
Di zaman yang modern
seperti sekarang ini, perkembangan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi melaju dengan
pesatnya. Tuntutan kebutuhan hiduplah yang menjadikan manusia giat
mengembangkan ilmu pengetahuan dan teknologi. Berbagai ilmu dikembangkan, mulai
dari ilmu sosial hingga ilmu eksak. Seperti salah satu ilmu eksak yaitu ilmu
kimia. Dalam praktiknya secara umum ilmu kimia, yaitu ilmu yang mempelajari
tentang sususnan, sifat, dan reaksi suatu unsur atau zat dalam berbagai
jenis benda material.
Dalam ilmu kimia banyak aspek-aspek penelitian
yang dilakukan. Seperti halnya, yang paling spesifik yaitu pemisahan molekul-
molekul dari senyawa zat nya, atau yang disebut dalam ilmu kimia yaitu Kromatografi. Kromatografi terbagi menjadi berbagai macam
lagi. Salah satunya yaitu “Kromatografi Cair Kinerja Tinggi” atau yang biasa di kenal HPLC.
Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan
tinggi, dan detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi
kolom cair menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang
tinggi. Metode ini dikenal sebagai kromatografi cair kinerja tinggi. Teknologi
kolom didasarkan atas penggunaan kolom berlubang kecil (diameter dalam antara 2
mm hingga 5 mm) dan isi kolom berupa partikel kecil (3mm hingga 50 mm), yang memungkinkan tercapainya keseimbangan secara
cepat antara fase gerak dan fase diam. Teknologi kolom partikel kecil ini
memerlukan sistem pompa tekanan tinggi yang mampu mengalirkan fasa gerak pada
tekanan tinggi sampai 300 atmosfer, agar tercapai laju aliran beberapa ml per
menit. Oleh karena sering digunakan jumlah zat uji yang kecil (umumnya lebih
kecil dari 20 mg) untuk isi kolom tersebut di atas, maka diperlukan
detektor yang sensitif. Dengan teknologi ini kromatografi cair dalam banyak hal
dapat menghasilkan pemisahan yang sangat cepat seperti pada kromatografi gas,
dengan keunggulan zat-zat yang tidak menguap atau tidak tahan panas dapat
dikromatografi tanpa peruraian atau tanpa perlunya membuat derivat yang dapat
menguap.
Fase diam dapat berupa cairan atau polimer, yang disalut
atau terikat secara kimia pada permukaan penyangga sebagai lapisan tipis, yang
mengurangi hambatan terhadap pemindahan masa, sehingga keseimbangan antara fase
gerak dan fase diam dapat tercapai dengan cepat. Suatu fase diam cair harus
mempunyai sifat praktis tak bercampur dengan fase gerak, umumnya fasa gerak
perlu dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase diam cair, agar fase diam tidak
terbawa dari kolom. Fase diam berupa polimer yang disalutkan pada penyangga
umumnya lebih dapat bertahan. Suatu fase diam yang terikat secara kimia pada
penyangga lebih mudah pemakaiannya dengan beraneka ragam pelarut serta suhu
yang lebih tinggi.
Komposisi fase gerak berpengaruh nyata terhadap kinerja
kromatografi dan harus dikendalikan dengan cermat. Komposisi dapat mempunyai
pengaruh yang jauh lebih besar terdadap faktor kapasitas daripada suhu, (faktor
kapasitas = k adalah perbandingan
waktu yang diperlukan selama berada dalam fase diam terhadap waktu yang
diperlukan selama berada dalam fase gerak).
Bahan pengisi kolom lainnya dengan diameter yang lebih
kecil, antara 3 mm hingga 10 mm, hampir seluruhnya berpori dan memberikan pemisahan
yang lebih efisien dari pada partikel pengisi kolom berukuran antara 30 mm hingga 50 mm. Partikel tersebut dapat pula dibuat bersifat adsorpsi
atau dilapisi dengan suatu fase diam. Dalam hal ini pengisian ke dalam kolom
harus dibuat dalam bentuk bubur untuk mendapatkan efisiensi kolom yang tinggi,
berbeda dengan partikel berukuran antara 30 mm hingga 50 mm yang dapat diisikan dalam bentuk kering.
Tiga bentuk kromatografi cair kinerja tinggi yang paling
banyak digunakan :
1.
Kromatografi
penukar ion terutama digunakan untuk pemisahan zat-zat larut dalam air yang
ionik atau yang dapat terionisasi dengan bobot molekul kurang dari 1500. Fase
diam pada kromatografi penukar ion umumnya resin organik sintetik dengan gugus
aktif yang berbeda-beda. Pada resin penukar kation terdapat gugus aktif yang
bermuatan negatif dan resin ini digunakan untuk pemisahan zat-zat bersifat
basa, misalnya amina. Sebaliknya pada resin penukar anion teredapat gugus aktif
bermuatan positif yang akan zat-zat dengan gugus fosfat, sulfonat atau
karboksilat, yang bermuatan negatif. Senyawa larut air yang ionik atau yang
dapat terionisasi akan mengalami tarikan oleh resin, dan perbedaan dalam
afinitas akan menyebabkan terjadinya pemisahan kromatografi. pH fase gerak,
suhu, jenis ion, konsentrasi ionik, dan senyawa organik tertentu yang berfungsi
untuk memodifikasi dapat mempengaruhi tertariknya zat terlarut, dan
variabel-variabel tersebut dapat diatur agar diperoleh derajat pemisahan yang
diinginkan.
2.
Pada
kromatografi partisi digunakan fase gerak dan fase diam dengan polaritas yang
berbeda. Jika fase gerak bersifat polar dan fase diam non-polar, dikenal
sebagai kromatografi fase balik, maka senyawa non-polar yang larut dalam
hidrokarbon, dengan bobot molekul kurang dari 1000, seperti vitamin larut lemak
dan antrakinon, dapat dipisahkan berdasarkan atas afinitasnya terhadap fase
diam. Modifikasi pelarut fase gerak yang polar dengan pelarut yang kurang polar
menyebabkan berkurangnya afinitas serta retensi senyawa pada kolom. Jika fase
gerak bersifat non polar dan fase diam polar, maka zat yang bersifat polar,
seperti golongan alkohol dan amina dapat dikromatografi. Fase gerak yang
non-polar dapat dimodifikasi dengan suatu pelarut yang lebih polar, untuk
mengurangi retensi dan mengubah pemisahan.
3.
Beraneka
ragam senyawa non ionik dapat dikromatografi dengan kromatografi adsorpsi,
dengan memilih fase diam dan fase gerak yang tepat.
BAB
II
PEMBAHASAN
1.
Pengertian
HPLC
HPLC adalah singkatan dari High
Performance Liquid Chromatography, yaitu alat yang berfungsi mendorong analit
melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat
kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak)
pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara mendasar merupakan
perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes
melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan
400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
HPLC
memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material
terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar
berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini
memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.Sampel yang akan dianalisis
dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi
kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan
alat ini adalah mengetahui kadar asam organik.
Banyak dari
pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan fase bergerak.
Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan
suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan
menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk
berdifusi, dan menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu
air dan zat-zat organik seperti methanol. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan
harus di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa
larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening, karena syarat
sampel yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan
harus bening.
Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya.
Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji
diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan
terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan
afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector
(spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang
tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh
recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau
menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC
tersebut.
2. Fasa gerak dan
fasa diam dalam HPLC
Di
dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah salah satu
dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas
pada solven yang digunakan untuk KCKT,
tetapi ada beberapa sifat
umum yang disukai, yaitu fasa gerak
harus :
·
Murni, tidak terdapat
kontaminan
·
Tidak bereaksi dengan
wadah (packing)
·
Sesuai dengan defektor
·
Melarutkan sampel
·
Memiliki viskositas
rendah
·
Bila diperlukan,
memudahkan "sample recovery"
·
Diperdagangan dapat
diperoleh dengan harga murah (reasonable price)
Fasa diam yanng biasa
digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik dimana R adalah rantai alkana
C-18 atau C-8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya
(gradien elusi). Misalnya air: asetonitril (80:20). Hal ini bergantung pada
kepolaran anallit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan kecepatan untuk sampai ke detektor (waktu
retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang
puncak-puncaknya terpisah
3. Komponen-komponen
HPLC
Keterangan
:
1. Botol
pelarut (reservoir)
Botol untuk fase gerak (mobile
phase) dapat berisi campuran eluen atau eluen murni disesuaikan dengan
kepentingan analisa.
2. Pompa
(pump)
Pompa berfungsi untuk memompa baik
eluen dan sampel yang disuntikan melalui injektor. Sebagian besar pompa HPLC
memiliki keluaran tekanan (output pressure) 1000-6000 psi dan mampu
menghasilkan aliran sampai 20 mL/menit.
3. Injektor
(injector)
Injektor adalah tempat untuk
menyuntikan sampel ke dalam kolom. Sampel yang akan dimasukkan ke bagian
ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom.
4. Kolom
(coloum)
Kolom merupakan bagian yang sangat
penting dari disebut cartridge, ada pula yang terbuat dari stainless steel.
Kolom terdiri dari fase diam (oktil, oktadesil, fenil, nitril, amin, dll) yang
terikat secara kimia dengan partikel-partikel silika berpori yang terdapat
dibagian dalam kolom.
Berhasil atau gagalnya suatu
analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.
Kolom dapat dibagi menjadi dua
kelompok :
1) Kolom
analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material
pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100
cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
2) Kolom
preparatif: umumnya memiliki diameter 6
mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari
stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga
digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi
eksklusi. Pengepakan kolom tergantung
pada model KCKT yang digunakan
(Liquid Solid Chromatography, LSC;
Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion
Exchange Chromatography, IEC,
Exclution Chromatography, EC)
5. Detektor
(detector)
Detektor yang paling banyak
digunakan adalah detector ultra violet (UV)/Visible, fluorometer (terutama
untuk zat yang memiliki panjang gelombang eksitasi dan emisi) dan detektor
indeks bias.
Suatu
detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom
(analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor
yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah,
kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa.
Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan
fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat
diperoleh. Detektor KCKT yang umum
digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat
digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas.
Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi
eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif
jika dibandingkan dengan detektor UV.
6. Komputer
(PC) dan Printer
Komputer berisi software pengolahan
data yang menampilkan grafik dari pembacaan absorbansi sampel terhadap
perubahan waktu. Grafik hasil pembacaan disebut kromatogram.
1.
Cara Menggunakan HPLC
Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu
mula-mula sampel diinjeksi dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection
hall. Dari injection hall ini proses utama cara kerja HPLC dimulai,
yaitu dengan memompa sampel ke kolom oleh LC20AT dalam tekanan tinggi.
Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah
dengan fase diam yaitu biasanya H2SO4 0,05 N dan CH3OH
berdasarkan afinitas elektron. Setelah terpisah, dengan berbagai perhitungan
matematis, HPLC yang sudah disambungkan dengan komputer ini memberikan
pembacaan berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan di bawah peak
untuk mengetahui kadar analit.
Rumus perhitungannya adalah y = ½ b.h yaitu persamaan
yang diplotkan dengan least square. Sesuai dengan pengerjaan least
square, maka sebelum menggunakan HPLC untuk analit, kita harus membuat
kurva standar terlebih dahulu dengan menggunakan larutan standar.
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa
gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari
senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada
kolom.
Diagram alir HPLC
Adapun cara untuk melihat seluruh proses diagram alir
HPLC, antara lain:
a. Injeksi sample
Proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.
b. Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan
oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor Waktu retensi diukur
berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan
ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda
memiliki waktu retensi yang berbeda.
c. Detektor
Ada beberapa cara untuk
mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai
untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.
d. Interpretasi output dari
detector
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing
puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menyerap
sinar UV. Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang
melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar
komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat
sederhana).Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang
meskipun waktu retensi akan sama.
Kelebihan dan Kekurangan HPLC
a.
Kelebihan High Performance Liquid Chromatografi:
·
Isolasi zat yang tidak mudah menguap (non volatile)
·
Isolasi zat yang secara termal tidak stabil
·
Dapat diopersikan pada suhu kamar
·
Mampu memisahkan
molekul-molekul dari suatu campuran
·
Sudah digital sehingga
penggunaannya cepat, mudah dan lebih praktis
·
Kecepatan analisis dan
kepekaan yang tinggi
·
Dapat dihindari
terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
·
Resolusi yang baik
·
Dapat digunakan
bermacam-macam detektor
·
Kolom dapat digunakan
kembali
·
Mudah melakukan
"sample recovery"
b.
Kekurangan High Performance Liquid Chromatografi:
· Larutan
harus dicari fase diamnya terlebih dulu
· Hanya
bisa digunakan untuk asam organic
· Harus
mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi
· Harganya
mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas
BAB III
KESIMPULAN
1.
HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid
Cromatography, yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom
dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan
kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi
melalui kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat
tinggi dari kromatografi kolom.
2. Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit
berdasarkan kepolarannya sedangkan prinsip kerja
dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam
kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi
senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan kepolaran afinitasnya. Hasil
pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV,
fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil yang
muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya
dapat ditampilkan menggungakan integrator atau menggunakan personal computer
(PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.
3. Keuntungan dari penggunaan HPLC
yaitu :
·
Lebih teliti
·
Sudah digital sehingga penggunaannya
cepat dan lebih praktis
·
mampu memisahkan
molekul-molekul dari suatu campuran
·
mudah melaksanakannya
·
kecepatan analisis dan
kepekaan yang tinggi
·
dapat dihindari
terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
·
Resolusi yang baik
·
dapat digunakan
bermacam-macam detektor
·
Kolom dapat digunakan
kembali
·
mudah melakukan
"sample recovery"
4. Kerugian dari penggunaan
HPLC yaitu :
·
Larutan harus dicari fase diamnya
terlebih dulu
·
Hanya bisa digunakan untuk asam organic
·
Harus mengetahui kombinasi yang optimum
antara pelarut, analit, dan gradien elusi.
·
Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian
yang terbatas
